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    银屑病患者血清IL-26蛋白和全血Th17细胞因子mRNA表达水平的测定
    发布时间:[2015-06-18 09:34] 点击次数:
    对象与方法
            研究对象入选病例为郑州大学第一附属医院2012年12月至2013年5月皮肤科住院部收治的加重期银屑病患者47例,其中男19例,女28例;寻常型15例,脓疤型12例,红皮型11例,关节型9
    例。所有银屑病患者均由2名以上副主任及以上技术职称医师确诊。患者近2周内未外用糖皮质激素、维生素衍生物、他克莫司等药物,2周内未行光线疗法或光化学疗法治疗,1个月内未口服维酸类、糖皮质激素及免疫抑制剂等药物,无系统性红斑狼疮等其他免疫性皮肤病及重要脏器器质性病变,采血前检查血常规、肝功能、肾功能均无异常。健康对照组为郑州大学第一附属医院体检中心的47例健康体检者,采集血样前1个月内无感染情况,既往无银屑病、血管炎等免疫相关性皮肤病病史。该研究经郑州大学第一附属医院伦理委员会的审查并获得批准同意。每位研究对象(包括病例与对照)在正式参加研究前均必须签署知情同意书,方可为正式研究对象,确保了该研究符合赫尔辛基伦理原则要求。银屑病组年龄( 33. 5 ± 16. 9 )岁,患病时间(4.6±3.6) a,皮损面积和严重程度指数(PASI )为(12. 12 ±3. 02)。健康对照组年龄、性别与银屑病组相匹配。
            主要试剂和仪器IL-6 ELISA检测试剂盒(美国BD公司),RNAiso Plus、SuperQuickRT MasterMix反转录试剂盒和U1traSYB RMixture(北京康为世纪公司)、实时荧光定量PC R引物(上海生土生物土程技术服务有限公司)、酶标仪(美国BioAD公司)、实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)、台式高速冷冻离心机(美国Heal Force公司)。
            2组血清IL-6蛋白的测定采集静脉血2mL  EDTA:抗凝,混匀。2组血清IL-6水平用IL-6 ELISA检测试剂盒测定,严格按照说明书进行操作。IL-6 ELISA检测试剂盒的测定范围为8-1 000 ng/L。用酶标仪测定A值,测定波长为450 mm。
            2组全血Th17细胞因子mRNA表达水平的测定。
            总RNA提取吸取全血100 p,L,与RNAisoPlus 200μL一起置于1.8 mL离心管中,加入氯仿,混匀,室温静置5 min,于4℃   12 000 g离心15min。吸取上清液至另一个1. 8 mL离心管中,加入异丙醇,充分混匀,室温放置10  min后,于4℃12 000 g离心10 min。弃去上清,缓慢沿管壁加入体积分数75%乙醇750 pL,于4℃12 000 g离心5min。弃去所有上清,在超净土作台中干燥沉淀5min。加入无RNA酶的去离子水完全溶解RNA沉淀后,溶解液至于紫外分光光度仪中进行测定,读取260与280 nm的A值,利用A (260 nm) /A (280 nm)比值估核酸的纯度,A (260 nm) /A (280 nm)比值控制在1.8-2.0。
            RNA样本反转录利用SuperQuickRT Mas-terMix进行RNA反转录。按照试剂盒提供的反应体系进行反转录反应。反应条件:37℃15 min  85℃  5  s。-20 ℃保存。
            统计学处理采用SPSS 19. 0对数据进行分析。所有连续性变量均符合正态分布,方差齐同。银屑病组和健康对照组之间血清IL-6蛋白水平和IL-7A, L-2, IL-6 mRNA表达水平的比较采用两独立样本的t检验;银屑病患者血清IL-6水平与PASI的相关性采用Pearson相关分析;不同类型银屑病患者间全血IL-7A,IL-2,IL-6 mRNA表达水平的比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验。检验水准a=0.05s。
     
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